（一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用）

　　1.本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：2.紅色食品是指食品為紅色、橙紅色或棕紅色的食品。這類食品富含天然活性植物色素(如番茄紅素、花青素、辣椒紅素、甜菜紅素等)、胡蘿卜素、鐵、蛋白質(zhì)和部分氨基酸，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、b族維生素和多種無機(jī)鹽的重要來源，可以彌補(bǔ)粳米、白面中的營養(yǎng)缺失?？茖W(xué)研究表明，紅色食品有治療缺鐵性貧血和緩解疲勞的作用，對(duì)乳腺癌等腫瘤疾病有防治作用，給人以興奮感，有增加食欲，光潔皮膚，增強(qiáng)表皮細(xì)胞再生和防止皮膚衰老，預(yù)防感冒等作用。經(jīng)常食用紅色食品，可以進(jìn)一步提高對(duì)主食中營養(yǎng)的利用率，山楂、紅參等食品還有治療癌癥的功效。被稱為“紅色生力軍?！睜I養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為，紅色蔬果最典型的優(yōu)勢在于它們都是富含天然鐵質(zhì)的食物，例如常吃的花生、大棗等都是貧血患者的天然良藥，也適合女性經(jīng)期失血后的滋補(bǔ)。所以，紅色蔬果，女人盡可放心多吃。紅色食品中還含有致病微生物的“殺手”一一巨噬細(xì)胞，可以有效地抵御感冒病毒等微生物，增強(qiáng)人體抵抗感冒的能力。3.但是上述涉及的紅色食品傳統(tǒng)的應(yīng)用方法大多作為普通食品或者提取其中的活性天然植物色素進(jìn)行開發(fā)利用，極少關(guān)注其中的蛋白質(zhì)類成分。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種食物的蛋白水解物(小分子肽)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，而市面上一些普遍的抗氧化劑如維生素e等,雖然能夠清除活性氧，但對(duì)已造成的損傷修復(fù)效果較弱且會(huì)產(chǎn)生副作用。本發(fā)明對(duì)紅色食品中的復(fù)合小分子肽進(jìn)行開發(fā)利用，彌補(bǔ)了普通抗氧化劑不具有損傷后修復(fù)功能的缺陷,更全面地開發(fā)利用了紅色食品的營養(yǎng)價(jià)值。4.采用酶水解蛋白制備抗氧化肽是主流的方法，但由于許多蛋白酶有特異性的酶切位點(diǎn)及蛋白質(zhì)氨基酸序列的獨(dú)特性，因此選用不同的蛋白及酶組合對(duì)于生成具有獨(dú)特功能性的肽化合物具有重要意義。就現(xiàn)有的酶解方法而言，有些使用了無特異性或廣泛特異性的蛋白酶，這樣的生產(chǎn)重復(fù)性低并且會(huì)產(chǎn)生游離氨基酸，或是肽鏈會(huì)被水解的過小導(dǎo)致功能性降低，最后產(chǎn)物的收率也較低，總體而言還缺乏穩(wěn)定、高效制備抗氧化肽的方法。5.本申請(qǐng)的發(fā)明人在先申請(qǐng)cna公開了一種紅色食品復(fù)合小分子肽及制備方法和在細(xì)胞修復(fù)中的應(yīng)用，包括以下原料：赤小豆、紅米、紅慧米、紅南瓜、花生、大棗、山楂、紅藜麥、枸杞子、洛神花、紅參；所述基于紅色食品原料的復(fù)合小分子肽的制備方法包括以下步驟:原料粉的制備；發(fā)酵產(chǎn)物的制備；酶解產(chǎn)物的制備；復(fù)合小分子肽成品的制備。本發(fā)明提出的復(fù)合小分子肽，具有純天然，無添加的特點(diǎn)，色澤鮮紅誘人，食欲感強(qiáng)，食用人群廣，口感好，營養(yǎng)價(jià)值高，具有修復(fù)受損細(xì)胞、延緩衰老、去除氧自由基、補(bǔ)氣血及增強(qiáng)免疫力的保健功效。但是，由于該多肽水解物中活性成分含量較低，特別是作為活性成分的adf的抗氧化性還有待進(jìn)一步提高，由此所得到的多肽水解物除濕的效果有待進(jìn)一步改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：6.本發(fā)明的目的是提供一種除濕的發(fā)酵型小分子肽及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明擬采用如下的技術(shù)方案：7.本發(fā)明一方面涉及一種除濕的發(fā)酵型小分子肽，其包括adfw和hadf。8.在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述adfw的含量為0.9wt％以上，hadf的含量為0.7wt％以上。9.本發(fā)明另一方面還涉及含有上述發(fā)酵型小分子肽的水解物，其中包含60wt％以上的短肽，所述短肽是指肽鏈長度為10個(gè)以下3個(gè)以上的肽。10.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物的制備方法，其特征在于通過如下步驟制備得到：11.(1)將重量份為赤小豆200～300；紅米紅慧米紅南瓜花生山楂紅糖大棗50～100；紅藜麥枸杞子子猴頭菇粉茯苓10?30；洛神花紅參破壁粉碎，溶解在水中；12.(2)加入纖維素酶和果膠酶的混合物，調(diào)節(jié)ph至4?5，加熱反應(yīng)液至50?60℃，放入攪拌器中，酶促水解1?3小時(shí)；13.(3)水解之后加入胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶，攪拌均勻得到反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph至7?8，加熱反應(yīng)液至50?60℃，放入攪拌器中，酶促水解時(shí)間為2?4小時(shí)；14.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶，在ph6.5?7.5和50?60℃溫度下進(jìn)行酶促水解3?5小時(shí)；15.(5)在熱處理使酶變性；16.(6)離心并回收液相；17.(7)先通過4?6kda膜對(duì)液相進(jìn)行超濾和滲濾并回收滲透物；18.(8)再通過150?300da膜對(duì)來自超濾的滲透物進(jìn)行納米過濾并回收滲余物；19.(9)進(jìn)行冷凍干燥，得到水解物。20.本發(fā)明另一方面涉及上述小分子肽作為抗氧化劑和/或除濕中的應(yīng)用。21.本發(fā)明另一方面還涉及上述水解物在除濕中的應(yīng)用以及在制備治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹和/或皮膚瘙癢的藥物或食品中的應(yīng)用。22.有益效果23.本發(fā)明通過采用合適的水解條件，制備得到了富含本發(fā)明小分子肽的水解物，本發(fā)明的小分子肽具有較高的抗氧化活性，由此所得到的多肽水解物對(duì)于除濕，特別是治療丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢具有重要意義。有望在抗衰老、美容方面取得功效。具體實(shí)施方式24.為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。25.如無特殊說明，本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。26.實(shí)施例1：27.(1)稱量赤小豆300g、紅米300g、紅慧米300g、紅南瓜300g、花生200g、山楂150g、紅糖150g、大棗100g、紅藜麥50g、枸杞子30g、猴頭菇粉30g、茯苓30g、洛神花30g及紅參30g；水清洗干凈，烘干去除水分并使用破壁機(jī)破壁粉碎，備用；28.(2)加入纖維素酶(2.0％/dm)和果膠酶(1.0％/dm)的混合物，調(diào)節(jié)ph至4.5，加熱反應(yīng)液至55℃，放入攪拌器中，在40rpm的條件下反應(yīng)，酶促水解2小時(shí)；29.(3)水解2小時(shí)之后加入胰蛋白酶(1.5％/dm)和菠蘿蛋白酶(2.0％/dm)，攪拌均勻得到反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph至7.5，加熱反應(yīng)液至55℃，放入攪拌器中，在40rpm的條件下反應(yīng)，酶促水解時(shí)間為3h；30.(4)水解之后加入絲氨酸蛋白酶(1.5％dm)，在ph7.0和55℃溫度下進(jìn)行酶促水解4小時(shí)；31.(5)在85℃下熱處理45分鐘以使酶變性；32.(6)離心并回收液相；33.(7)先通過5kda膜對(duì)液相進(jìn)行超濾和滲濾并回收滲透物；34.(8)再通過200da膜對(duì)來自超濾的滲透物進(jìn)行納米過濾并回收滲余物；35.(9)進(jìn)行冷凍干燥，得到水解物。經(jīng)過測試，所述水解物中包含62％重量的短肽、27％的多糖以及11％的其它物質(zhì)。36.比較例1：37.參照實(shí)施例1，其區(qū)別在于步驟(3)中不加入胰蛋白酶。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含47％重量的短肽、35％的多糖以及18％的其它物質(zhì)。38.比較例2：39.參照實(shí)施例1，其區(qū)別在于步驟(3)中不加入菠蘿蛋白酶。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含37％重量的短肽、32％的多糖以及31％的其它物質(zhì)。40.比較例3：41.參照實(shí)施例1，其區(qū)別在于先進(jìn)行步驟(4)，再進(jìn)行步驟(3)。由此得到的得到水解物，經(jīng)過測試，所述水解物中包含53％重量的短肽、28％的多糖以及19％的其它物質(zhì)。42.對(duì)于上述水解產(chǎn)物，通過測定orac值(μmolte/mmol)和dpph值(μmolte/mmol)來比較其抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。43.表1：水解物抗氧化活性測試結(jié)果44.45.從上述比較結(jié)果來看，實(shí)施例1的抗氧化活性高于比較例1?3，由此說明實(shí)施例1的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性。46.對(duì)于由實(shí)施例1和比較例1?3所得到的水解物，分析其包含的短肽的含量，通過檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例1中豐度最高的短肽為adfw和hadf，其含量達(dá)到水解物的0.92％和0.76％，而在比較例中adfw和hadf的含量最高的是比較例3，僅為0.57％和0.53％。47.為了進(jìn)一步確定是否是由于adfw和hadf的存在使得水解物的抗氧化活性較高，對(duì)于檢測出的豐度較高的短肽，使用通常的肽的化學(xué)合成方法即fmoc固相合成法來合成，作為抗氧化活性測定用的樣品，作為比較，以cna所得到的豐度最高的adf作為對(duì)照。對(duì)于合成的短肽，測定orac值(μmolte/mmol)dpph值(μmolte/mmol)，將各肽序列的分析結(jié)果匯總于表2。48.表2：短肽抗氧化活性測試結(jié)果[0049][0050]基于上表可以看出，通過同時(shí)包含表現(xiàn)出高orac值和表現(xiàn)出高dpph值的adfw和hadf，從而使得水解物的抗氧化性能全面優(yōu)異，特別是，相比于cna所公開的adf，本發(fā)明的肽具有更高的抗氧化活性。[0051]水解物除濕效果:[0052]一、臨床資料[0053]試驗(yàn)方法：隨機(jī)、陽性藥對(duì)照臨床研究。[0054]安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)：一般體格檢查，血、尿、大便常規(guī)，肝、腎功能、心電圖，不良反應(yīng)等。[0055]病例數(shù)：治療組40例，陰性對(duì)照組40例，陽性對(duì)照組40例，共120例,臨床表現(xiàn)丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。[0056]二、試驗(yàn)藥品[0057]治療組：本發(fā)明實(shí)施例1所制備得到的水解物，每次10g，溫開水送服，每日3次。[0058]陰性對(duì)照組：不進(jìn)行處理。[0059]陽性對(duì)照組：cna實(shí)施例1所制備的小分子肽溶液，每次40g(干物質(zhì)量為10g)，加熱后送服，每日3次。[0060]三、受試者治療[0061]療程：1周，觀察期內(nèi)，每天隨訪1次，除有嚴(yán)重不良反應(yīng)者外，觀察1周后，一般不再進(jìn)行隨訪。[0062]四、統(tǒng)計(jì)結(jié)果[0063][0064]從上表可以看出，采用本發(fā)明的水解物能夠有效緩解丘疹樣蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢。此外，在觀察期間未見明顯不良反應(yīng)，也未見肝、腎功能及造血系統(tǒng)損害，表明本發(fā)明的小分子肽使用安全。[0065]以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)在此公開的實(shí)施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和變化。